Автобусы будут курсировать между музеями ночной программы в черте города с 23:00 до 06:00 по пяти маршрутам. Маршруты «Центр–1», «Центр–2», «Центр–3» и «Васильевский остров — Петроградская сторона» пересекаются на Исаакиевской площади. На маршрут «Центр–4» можно пересесть с маршрута «Центр–2» на остановке на улице Марата. Воспользоваться автобусами может любой обладатель билета «Ночи музеев» — это бесплатно.

Маршрут «Центр–1» пройдет от Исаакиевской площади до проспекта Стачек, маршрут «Центр–2» — до Литейного проспекта, маршрут «Центр–3» — до площади Александра Невского, маршрут «Васильевский остров — Петроградская сторона» — по Васильевскому острову и Петроградской стороне (по Дворцовому, Биржевому мостам и мосту Бетанкура). Маршрут «Центр–4» курсирует между остановкой маршрута «Центр–2» на улице Марата и Днепропетровской улицей.

Когда мосты через Неву будут разведены, автобусы маршрута «Васильевский остров — Петроградская сторона» будут ходить только по Васильевскому острову и Петроградской стороне — через мост Бетанкура и без заезда на Исаакиевскую площадь.

Интервал движения автобусов «Ночи музеев» зависит от трафика — в среднем он составляет 15 минут.